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　　非洲豬瘟病毒的傳播性是很廣泛的，不光傳播速度快，傳染的面積也很大，而且致死率很高。各種年齡和品種的豬是本病的易感動物，豬群一旦感染，迅速傳播，病死率高達 100。野豬和軟蜱是非洲豬瘟病毒的儲存宿主，病毒一旦傳入野豬和軟蜱，會使病毒在野生感染圈中存在，難以*，但人和其他動物不會感染本病。非洲豬瘟的暴發和流行會對養豬業危害是毀滅性的，發生后對生豬生產、人民收入、肉食品供應和食品安全等諸多方面產生重要影響，進而危害人民生活質量和社會穩定。

　　【產品名稱】

　　通用名稱：病毒DNA提取試劑盒

　　英文名稱：Extraction Kit for Virus DNA

　　【預期用途】

　　本試劑盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、組織、飼料及環境中的病毒DNA的提取，純化的核酸可適用于各種常規操作及PCR試驗。

　　【試劑盒組分】

　　I、試劑盒組成及貯藏條件

　　2、 保存條件及有效期：室溫下保存，有效期12個月.

　　3、 需自備材料：無水乙醇、1.5 mL無菌離心管、1.5 mL無菌離心管(長臂型)、生理鹽水、研缽、無菌

　　1mL, 2OOuL、10uL槍頭、記號筆等。

　　【操作步驟】

　　一、樣品制備

　　1、 血液樣品：抗凝血樣品置離心管中，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上層血漿;非抗凝血樣品置離心 管中，待凝固后，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上層血清，置于滅菌離心管中，編號待檢。

　　2、 組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體等病變組織樣品0.1g.組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入1 mL生理鹽水混勻，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心骨中，編號待檢。

　　3、 口腔液：進食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉線綁紗布團吸引動物咀嚼，收集口腔液大于 500uL， 8000轉/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。

　　4、 飼料：取適量研磨后的飼料(約0.2g)，放入含1 mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2 mL EP 管屮，振蕩混勻，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中,編號待檢.

　　5、 灰塵：用無菌棉簽蘸取適量環境表面上的灰塵，放入含1 mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2 mL EP管中，振蕩混勻，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。

　　二、DNA的提取

　　1、取裂解液200uL加入無核酸酶1.5 mL離心曾屮，分別加入血漿/血清/組織液等樣品液200uL. 震蕩混勻10秒或顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘(如果室內溫度較低時.需放置25C水浴溫育)，再加入200uL無水乙醇，顛倒混勻10秒;若樣品渾濁則先12000轉/分鐘離心1分鐘處理，取上清液，以避免堵塞柱子;

　　2、 將液體轉入套有收集管的吸附柱中， 12000rpm離心1分鐘：

　　3、 棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液I , 12000 rpm離心1分鐘;

　　4、 棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液II， 12000 rpm離心I分鐘;

　　5、 棄收集管液體，12000 rpm離心2分鐘，以*去除殘留洗液;

　　6、將吸附柱轉入新的無核酸酸1.5mLEP管(長臂型)中，向柱滴加50 uL洗脫液，靜置1分鐘, 12000 rpm離心1分鐘，EP管中液體即為病毒DNA。

　　【注意事項】

　　1、 實驗前諾仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟執行.在操作過程中對時間、試劑體積等 粘確控制可以獲得好的結果。

　　2, 樣本應新鮮采集使用，或低溫運輸儲存;

　　3, 樣本具有潛在感染風險，核酸的提取應在核酸提取實驗室的生物安全柜中進行。

　　4、 核酸提取冇關耗材確保高溫滅菌，提取后核酸盡快進入下一步試驗或冷凍保存待用。

　　5, 試劑使用前應混合均勻，試劑具有一定腐蝕性，使用時請戴手套等防護用品做好防護。

　　6. 低溫下裂解液出現結晶數屬正常現象，可在60°C水浴加熱助溶后使用。

　　7、 實驗產生的廢棄物應及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

　　僅供獸醫診斷使用

　　非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

　　【獸藥名稱】

　　通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

　　漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名稱：無

　　【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

　　【用法與判定】

　　1 用法

　　1.1待檢樣品釆集、保存及運輸

　　1.1.1樣品釆集

　　(1) 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

　　(3) 病豬污染的周邊環境 采集與病豬相關場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

　　1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應不超過24小時，-70°C條件下保存，避免反復凍 融。

　　1.1.3樣品運輸泡沫箱加冰袋后密封進行運輸。包裝和運輸應符合《高致病性動 物病原微生物菌(毒)種或者樣品運輸包裝規范》和關于危險品運輸管理的有關規定。

　　1.2樣品處理

　　1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號待檢。

　　1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000 r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

　　1.2.3環境樣品處理

　　1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中，編號備用。

　　1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進行DNA核酸提取。

　　1.4熒光PCR反應：

　　1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設被 檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應體系配制如下：

　　試劑 體系

　　PCR 反應液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應管。

　　1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應管蓋，混勻后瞬時離心，轉移到熒光PCR儀器 上。

　　144將PCR反應管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運行以下程序：

　　熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環的55℃時采集熒光信號。設置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。(注：若熒光PCR儀(如AB17500)按說明 書中的反應程序設置后因持溫時間短無法運行，可將預擴增和PCR擴增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2結果判定

　　2.1試驗有效性判定

　　陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數增。則判試驗結果有效。否則，此次試驗視為無效。

　　2.2樣品判定

　　2.2.1陽性：樣本檢測結果Ct值≤35且有明顯指數增，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：樣本檢測結果Ct值在35?38范圍內。此時應對樣本進行重復檢測，如果重復實驗 結果Ct值仍在35?38范圍內，有明顯指數增.則判定為陽性，否則為陰性。

　　2.2.3陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　【注意事項】(1)實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟執行，在操作過 程中對時間、試劑體積等控制可以獲得好的結果。

　　(2) 實驗室應嚴格按照有關規定分區管理，依照配液區-模板提取區-擴增區-分析區順序 進行基因檢測。各區間人員、器材、試劑及空氣流向應有嚴格要求。

　　(3) 核酸提取有關耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進入 下一步實驗或凍保。

　　(4) 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

　　器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質一次性乳膠手套。

　　(5) 凍存試劑使用前應于室溫下*融化，瞬時離心使液體*沉于管底。避免反復凍融， 以免影響試劑性能。

　　(6) 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

　　(7) 擴增產物禁止開蓋，實驗產生的廢棄物應及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

　　【規格】50頭份/盒

　　【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個月。

　　【批準文號】獸藥生字163668871